中医药治疗呼吸道合胞病毒感染实验研究进展教育论文
【摘要】
按照体内体外不同研究途径，对近年来中医药治疗呼吸道合胞病毒（RSV）感染的实验研究进展进行综述，为以后相关研究进行展望。认为应该加强抗病毒作用环节和免疫学相关机制研究，以求开发针对RSV感染的抗病毒、提高机体抗病能力的新药，进而产生新的中医药理论来指导RSV的临床治疗。
【关键词】
呼吸道合胞病毒；实验研究；文献综述
呼吸道合胞病毒( Respiratory syncytial virus,RSV)是导致婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原,能引起支气管炎、毛细支气管炎、呼吸道合胞病毒肺炎等疾病，尚可诱发过敏症和哮喘[1-2]，某些体弱患儿可发生心力衰竭等危重情况，甚至可导致患儿死亡，严重危害婴幼儿健康,西医尚无安全有效的疫苗和药物控制[3]。中医药在抗RSV感染方面有独特的优势，多项临床研究证实其疗效显著，进一步阐释相关机理并开发安全有效的抗RSV感染药物有重大意义。本文仅就近年来中医药治疗RSV感染的实验研究进展综述如下。
1 体外实验研究
1.1单味药物研究
1.1.1药物有效成分实验研究
梁荣感等[4]观察大黄蒽醌类化合物对RSV引起的细胞病变(CPE)的抑制作用,结果证实其对RSV抑制作用存在明显的量效反应关系，证实RAA在人喉癌细胞（Hep|2）中对RSV有抑制作用。张凤梅等[5]通过细胞培养法观察败酱草抗病毒多糖AP4对RSV感染人宫颈癌细胞（Hela）的治疗作用，发现AP4抑制RSV的半数有效浓度(EC50)为0.097 mg/mL,治疗指数(TI)为114,证实败酱草抗病毒有效部位AP4在Hela细胞中对呼吸道合胞病毒有明显的抑制作用。王意忠等[6]采用细胞培养技术，利用CPE法观察栀子提取物ZG对RSV等6种呼吸道病毒致细胞病变的影响。实验结果显示,体外抗病毒试验中, 栀子提取物ZG 对RSV、甲型流感病毒等所致细胞病变有明显抑制作用。王秀琴等[7]采用煎煮法、二氯甲烷萃取法和柱层析法提取分离得到甘草抗病毒有效部位(GD4)，观察GD4在Hela细胞中对RSV的抑制作用。结果发现GD4对RSV的抑制作用存在量效关系；在感染后至少12 h以内给药, GD4能够有效抑制RSV的复制。认为GD4在Hela细胞中对RSV有明显的抑制作用。
1.1.2含药血清实验研究
杨洁等[8]采用水提醇沉法提取中药黄芩有效成分，采用观察细胞病变和MTT法,观察清热抗感冲剂及其含药血清在Hep|2细胞中抑制RSV的作用,结果发现黄芩提取物及其含药血清具有不同程度抑制RSV病毒复制的作用。赵宇红等[9]采用MTT比色法检测鱼腥草对Hep|2单层细胞的毒性作用,通过空斑试验和试管观察细胞病变法确定鱼腥草对RSV的抑制作用。结果显示鱼腥草(1∶10)可以完全抑制稀释度为10-5(100 CID50)的RSV、半数抑制10-4(1 000 TCID50)的RSV,可使空斑明显变小，认为鱼腥草注射液对RSV有体外抑制作用。
1.2 中药复方机理实验研究
1.2.1药物有效成分实验研究
杨道锋等[10]观察复方抗病毒制剂作用后的病毒对细胞的攻击作用，结果显示复方抗病毒制剂能抑制流感病毒的血凝活性和RSV对靶细胞的攻击作用，认为复方抗病毒制剂体外对流感病毒和RSV具有较强的抑制作用。王孟清等[11]将RSV接种于Hela细胞单层增殖，取不同浓度的截哮口服液药液加入病毒,观察在细胞单层上的空斑形成以判定病毒产量。结果截哮口服液使RSV产量减少,药物浓度的高低与病毒产量的高低呈明显的负相关；其对RSV有直接灭活作用，且能影响病毒的吸附与吸附后的复制过程。王桂亭等[12]通过银黄直接抗病毒、病毒感染细胞同时使用银黄、先使用银黄再感染病毒3种给药方法,观察Hep|2和Hela细胞病变效应。结果发现注射用银黄在Hep|2和Hela细胞上对RSV均有明显的抗病毒作用。认为注射用银黄对RSV具有抑制和直接杀灭的特异性。
冯旰珠等[13]以CPE法及四氮唑盐还原法(MTT法)比较不同药物浓度及不同给药方式下热毒宁对RSV的抑制作用效果，发现热毒宁注射液预防给药方式、细胞外直接灭活及治疗给药方式均有抗RSV作用,该抑制作用存在着明显的量效反应关系。认为热毒宁对RSV有直接灭活作用,对RSV侵入Hep|2细胞有阻断作用,对RSV在Hep|2细胞内增殖有抑制作用,相同浓度下,预防作用更显著。叶卉初等[14]将Hep|2细胞分成病毒唑、咳喘平、病毒唑+咳喘平3组,运用细胞培养技术，各细胞组加入RSVLong株病毒并分别加入上述3种药物的稀释液，通过观察CPE来观察RSV的抑制作用。试验表明,在用药量降至1/4时,在Hep|2细胞上连续观察5 d,仍不产生细胞病理变化,对RSV有完全抑制作用。说明两药联合应用时产生了很强的协同作用。
1.2.2含药血清实验研究
汪受传等[15]用不同剂量的清肺口服液制成含药血清处理RSV感染后的Hep|2细胞,用组织细胞培养法,采用CPE观察和MTT法检测清肺口服液含药血清对RSV感染细胞的增殖抑制作用。结果发现在Hep|2细胞上,清肺口服液的最大无毒浓度为1∶9。100 TCID50 RSV攻击后Hep|2细胞的OD值明显降低,加入中、高剂量含药血清后OD值升高。证实清肺口服液含药血清对RSV有抑制作用。廖辉等[16]在组织培养半数感染量以及含药血清对细胞最大无毒浓度测定基础上，行温度转换试验。结果显示：温度转换前（黏附阶段）加入金欣口服液含药血清，实验组和对照组OD值差异无统计意义；温度转换后（侵入阶段）加入金欣口服液,含药血清组OD值明显升高，与对照组比较差异有高度统计意义（P<0.01）。认为金欣口服液含药血清的抗病毒作用在RSV黏附后的膜融合及侵入阶段。廖辉等[17]将人胚肺成纤维细胞分组,RSV病毒攻击后,利用电镜观察各组人胚肺成纤维细胞超微结构的变化。结果表明:病毒感染组细胞核增大,核质比增加,核仁凝聚,核膜凹陷成夹层,包涵体形成,线粒体凝聚,粗面内质网扩张,溶酶体增多,核染色质浓缩,细胞外可见病毒颗粒。含药血清感染后给药组,细胞核增大,核仁凝聚,粗面内质网扩张,线粒体凝聚,但程度较轻。证实RSV感染人胚肺成纤维细胞后,细胞可出现超微结构的改变,清肺口服液含药血清可以减轻这种改变,感染时给药比感染后给药作用更明显。莫红缨等[18]以ELISA法测定炎症介质的含量,观察复方双黄连及其含药血清以不同的给药方式对RSV刺激A549细胞引发的炎症介质IL|8、IL|6、TNF|α释放的作用。研究发现双黄连复方及其含药血清均能显著降低RSV诱导A549释放的IL|8水平,并以感染前给药的途径下调IL|8的作用最为明显，在病毒感染的气道炎症控制中起着一定的作用。
2 体内实验研究
2.1 病毒抑制作用研究
徐霞等[19]用金贝清肺颗粒不同剂量给雄性BALB/C小鼠灌胃，3 d后鼻腔接种RSV，继续给药7 d，动物眼静脉丛取血,牵颈臼处死,无菌取肺组织,做肺组织病毒含量检测。结果显示，金贝清肺颗粒4个剂量组动物的肺组织病毒含量与模型对照组比较下降均超过一个指数。表明金贝清肺颗粒对小鼠体内RSV具有明显的抑制作用。吴成林等[20]在小鼠体内观察双黄连口服液对RSV染毒小鼠的死亡保护作用以及对小鼠心、脑、肺内病毒增殖的影响,发现双黄连口服液能抑制RSV的增殖,并见病毒的感染性滴度随药物浓度的增加而下降；治疗RSV感染鼠结果发现,双黄连口服液对RSV感染鼠有保护作用,随着药物剂量增加,疗效增强；该口服液还能降低组织内病毒滴度,阻止体内病毒复制,抗RSV作用类似于同剂量的病毒唑。
2.2 免疫功能调节作用机制研究
夏泉等[21]在小鼠感染RSV的同时,各给药组分别灌胃利巴韦林和莪术油油溶液,腹腔注射莪术油葡萄糖注射液。按肺质量除以体质量逐个计算肺指数（LI）和各组肺指数抑制率。结果表明，病毒对照组小鼠的LI明显增加，应用莪术油油溶液后,动物LI明显减低,治疗效果呈现较显著的剂量相关性。且高剂量莪术油油溶液治疗效果优于利巴韦林。此外，莪术油葡萄糖注射液和利巴韦林对RSV 感染小鼠的LI也具有明显的降低作用。郑淑梅等[22]对60例RSV肺炎患儿外周血T细胞亚群及血清白细胞介素-2水平进行测定，应用双黄连粉剂静滴治疗7 d，疗程结束后复查发现患儿CD+4、CD+4/CD+8及血清IL|2水平升高，CD+8降低，认为双黄连可调节T细胞亚群平衡、增强细胞免疫功能，对疾病康复有促进作用。
3结语
RSV感染对小儿和部分免疫功能低下的成年人健康构成较大威胁，日益为人们重视。中医药在抗RSV感染中展示了自身独有的优势，对其作用机制也进行了积极的`探索。随着研究的不断深入，细胞培养、MTT、血清药理学方法等研究手段逐渐为人们所熟知，细胞因子对炎症部位细胞凋亡机制的影响等分子生物学方面的研究也正为更多的研究人员所接受，但仍存在着研究方法单一、研究指标落后、研究思路和方法缺乏创新性等诸多问题。在抑制病毒的作用研究中，多是通过检测细胞病变改善的程度来描述药物的抗病毒作用，对于其具体作用环节尚缺乏详尽的研究，值得我们进一步深入探讨。可喜的是一些生物化学、免疫学等相关专业科研人员从研制新的有效单体等角度进行探索，为进一步揭示药物抗病毒规律及免疫学相关机制提供了新的方法，为中医药学的整体发展注入了新的力量，提供了新的思路。当前研制开发安全可靠的防治RSV感染的新药,仍是国际医学界有待解决的重要课题之一。
【参考文献】
[1]Durbin J E,Durbin R K.Respiratory syncytial virus|induced immunoprotection and immunopathology[J].Virual immunol,2004,17(3):370-380.
[2]Hacking D,Hull J.Respiratory syncytial virus|viral biology and the host response[J].J Infect,2002,45:18-24.
[3]Piedra P A.Respiratory syncytial virus vaccine: recent developments[J].Pediatr Infect Dis,2000,19:805-808.
[4]梁荣感，刘卫兵，李丽亚，等.大黄蒽醌类化合物体外抗呼吸道合胞病毒作用的研究[J].广西医科大学学报，2007，24（2）：280.
[5]张凤梅,李洪源,李霞，等.败酱草多糖体外抗呼吸道合胞病毒作用的研究[J].黑龙江医药科学，2006，29（1）：48.
[6]王意忠，崔晓兰，高英杰，等.栀子提取物抗病毒试验研究[J].中国中药杂志，2006,31(14):1176-1178.
[7]王秀琴，李洪源，刘鑫妍，等.甘草抗病毒有效部位(GD4)体外抑制呼吸道合胞病毒作用的研究[J].中药材，2006，29（7）：692-694.
[8]杨洁，刘萍.黄芩提取物及含药血清体外抑制呼吸道合胞病毒作用的实验研究[J].科学技术与工程，2007，7（12）：2784.
[9]赵宇红，申昆玲，刘亚谊，等.鱼腥草注射液治疗呼吸道合胞病毒感染的体外实验研究[J].首都医科大学学报，2005，26（5）：571.
[10]杨道锋,徐莉,邵静芳，等.复方抗病毒制剂体外抗流感病毒和呼吸道合胞病毒作用及毒性研究[J].医药导报，2008，27（4）：392.
[11]王孟清，罗银河,董晓斐，等.截哮口服液对呼吸道合胞病毒的抑制作用研究[J].中医药学刊，2006,24(5)：819.
[12]王桂亭,宋艳艳,任桂杰，等.注射用银黄体外抗呼吸道合胞病毒[J].中国新药与临床杂志，2005,24(11):887-889.
[13]冯旰珠,周锋,黄茂，等.热毒宁抗呼吸道合胞病毒(RSV,Long株)作用体外实验研究[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2007，27（9）：1009.
[14]叶卉初，刘玉华，侯安存，等.咳喘平与病毒唑联合应用体外对呼吸道合胞病毒抑制作用的研究[J].临床和实验医学杂志，2005,4(3):147-149.
[15]汪受传,王霖,陈超，等.清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究[J].南京中医药大学学报，2008，24（1）：25-26.
[16]廖辉，汪受传，徐建亚.金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒黏附、膜融合影响的实验研究[J].实用中西医结合临床，2008，8（1）：3.
[17]廖辉,王霖,汪受传.呼吸道合胞病毒感染细胞超微结构的改变及清肺口服液含药血清对其作用的研究[J].辽宁中医杂志，2008,35（5）：656-657.
[18]莫红缨，赖克方，江永南，等.双黄连对呼吸道合胞病毒感染的气道上皮细胞炎症因子释放的影响[J].广州医学院学报，2005，33（2）：16.
[19]徐霞,隋在云,隋丽云.金贝清肺颗粒体内抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究[J].时珍国医国药,2007，18（2）：403.
[20]吴成林，杨占秋，侯炜.双黄连口服液抗呼吸道合胞病毒的实验研究[J].数理医学杂志，2005，18（6）：592.
[21]夏泉，黄赵刚，李绍平，等.莪术油抗流感病毒和呼吸道合胞病毒作用的实验研究[J].中国药理学通报，2004，20（3）：357-358.
[22]郑淑梅，刘文彬，王太森，等.呼吸道合胞病毒肺炎免疫机制及双黄连疗效研究[J].实用儿科临床杂志，2004，19（12）：1041-1042.