FLAER多参数检测PNH克隆的影响论文
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，其发病机制主要是由于体细胞X染色体上的PIG-A基因突变，导致血细胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成障碍，锚连接蛋白缺失。传统的诊断方法主要有蔗糖溶血试验、酸溶血试验、尿含铁血黄素试验，但这些方法敏感性、特异性差。近些年来，通过流式细胞仪检测CD55、CD59已经成为诊断PNH的常规方法，特别是CD59，其敏感性高于CD55，在PNH 诊断过程中被认为是一个优于CD55 的指标。荧光标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变异体(FLAER)可以特异性的与GPI锚连蛋白结合，经流式细胞仪检测，其特异性和敏感性较传统方法更好。PNH、再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)均为骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制和临床表现，早期鉴别诊断常很困难。本文联合FLAER、CD45、CD15、CD24 多参数检测粒细胞PNH克隆以及CD59检测红细胞PNH 克隆，旨在有效提高PNH克隆检测的敏感性、特异性，有助于骨髓衰竭性疾病的早期鉴别诊断，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 所有病例均来自于本院血液科连续48例住院患者。其中PNH患者9例，AA患者13例，诊断均符合血液病诊断及疗效标准;MDS患者11例，符合2008年WHO诊断分型标准。对照组15例均为巨幼细胞性贫血患者。
1.2 仪器与试剂 FACSAria型流式细胞仪，溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)和CD59、CD45、CD15、CD24试剂和均购自BD公司，FLAER试剂购自加拿大Protox Biotech公司。
1.3 方法
1.3.1 外周血红细胞CD59检测 取EDTA 抗凝全血100μL，经PBS洗涤后稀释于1.5mL的PBS中，取100μL加入CD59-PE单抗20μL，4℃避光孵育30min后，1 000r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS液洗涤2遍，重悬于1mL PBS液中上机检测，用流式细胞仪测定CD59细胞的表达率。
1.3.2 外周血粒细胞FLAER检测 取EDTA抗凝全血100μL，加入CD45、CD15、CD24、FlAER抗体各20μL，避光孵育30min后，加入2mL溶血素，室温下避光10min，溶血完全后1 000r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS液洗涤2遍，重新悬于500μL的PBS液中液上机检测，用流式细胞仪测定FLAER的表达率。
1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验和Mann-Whitney U 检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床特征 PNH患者9例，男6例、女3例，年龄16～60岁，中位年龄30岁;AA患者13例，男5例、女8例，年龄7～63岁，中位年龄38;MDS患者11例，男5例、女6例，年龄41～72岁，中位年龄53岁，其中RCMD 1例，RCUD 6例，RAEB-Ⅰ2例RAEB-Ⅱ1例，5q-综合征1例;对照组15例，男6例、女9例，年龄19～61岁，中位年龄34岁。
2.2 不同方法对PNH 患者检测的比较 PNH 组患者FLAER缺失率和CD59缺失率分别为(70.07±28.77)%和(38.51±29.15)%，显著高于对照组、AA组、MDS组，差异有统计学意义(P<0.05)。FLAER检测结果明显高于CD59检测，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，有2例患者，一例CD59缺失率为7.8%，FLAER缺失率为88.1%;另一例CD59缺失率为5.5%，FLAER缺失率为23.2%。
2.3 不同方法对非PNH 患者检测的比较 各组中FLAER缺失率平均值均大于CD59缺失率，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明在非PNH组中FLAER和CD59检测无显著差异。对照组中FLAER缺失率为0.0%，特异性100%，有3例存在CD59缺失，缺失率均小于1%。13例AA 患者中5例检测出FLAER缺失，其中4例检测出CD59缺失，1例未检测出;11例MDS患者中3例检测出FLAER缺失，其中2例存在CD59缺失，1例CD59缺失率为0。结果说明FLAER检测比CD59检测更为敏感，特异性更好。
3 讨论
到目前为止，已经发现了20多种蛋白在PNH 患者血细胞表面表达缺乏，其中红细胞膜上衰变加速因子(CD55)和反应性溶血膜抑制物(CD59)的缺失被认为是引起PNH 病理生理的主要原因。红细胞数目多、抗体表达强是灵敏度检测最好的目标细胞。尤其是在一些粒细胞减少的疾病中如AA、MDS，红细胞检测尤为重要。同时，通过比较红细胞和白细胞的数值，可以给临床提供更多信息。CD55分子在红细胞上表达较低，而CD59分子的荧光染色强且均一，近些年来已成为PNH诊断的“金标准”。然而，越来越多的研究发现检测红细胞CD59表达对PNH 的诊断有一定的局限性。
本研究发现，在PNH组的两例患者中，一例CD59缺失率为5.5%，另一例CD59缺失率为2.9%，而FLAER缺失率分别为23.2%和47.7%。可能是由于患者正处于疾病的活动期，接受输血治疗，影响了红细胞CD59的表达，导致CD59表达出现假阳性。有研究表明，在小细胞低色素性贫血时，病人的红细胞膜表面的CD59表达均有降低，但粒细胞是正常的，若只检测红细胞的CD59会造成其表达假阴性。此外，正常细胞衰老时表面分子CD59还有可能自发丢失，均可导致检测值偏离事实。随着技术不断进步，人们研究出了FLAER 技术，FLAER是Alexa-488标记的无活性的嗜水气单胞菌溶素前体的变异体，可以特异性地与GPI锚链蛋白结合，在所有具有GPI锚连蛋白的粒细胞上均有特异性表达，不会因不同细胞表达GPI锚链蛋白的多少和种类不同造成误差。由于FLAER能直接检测GPI蛋白，有助于识别真正的PNH 和免疫性血细胞减少症，明确真正的GPI阴性细胞。本研究中对照组FLAER检测缺失率均为0，与CD59相比检验结果更具有特异性;在PNH组中，FLAER的缺失率显著高于CD59，敏感性更高。FLAER也是防止门内出现污染细胞最好的抗体。如果门内污染了少量的.CD24阴性表达的细胞群，可能会被误认为是小的PNH 克隆，而FLAER 与CD24一起使用可以提高PNH检测的准确性，CD24/FLAER双阴性细胞群才是真正PNH克隆细胞群。FLAER多参数检测要求外周血标本采集后必需及时送检，否则会导致粒细胞存活率下降，细胞非特异性染色增强，影响检测效果。这在一定程度上影响了FLAER在临床上的应用。PNH 克隆的检出对于MDS和AA的临床表现、治疗及转归有重要意义。部分具有PNH 克隆的AA患者对免疫治疗效果更好，即使小于0.1%的克隆也会影响治疗效果。
对于检测出少量PNH克隆的AA患者，需监测PNH克隆数的变化，因为患者有可能发展为溶血性贫血。在本研究中，PNH 与MDS的关系只局限在低危MDS中，表现为血细胞减少，骨髓增生低下;遗传学异常发生率低，临床过程惰性进展，更多地表现为骨髓衰竭的特点。AA 组、MDS 组中FLAER的缺失率均大于CD59的缺失率。由于AA和低增生性MDS的鉴别十分困难，但到目前为止还没有报道MDS的患者进展为PNH，监测PNH 克隆对于这两种疾病的鉴别具有一定的意义。AA、MDS患者中检测出的PNH 克隆常常很小，CD59检测不易测出。在这两组中各有1例患者CD59缺失率为0，而FLAER表达均有缺失，缺失率分别为4.2%、2.9%。FLAER检测更敏感，与CD59相比灵敏度更高。由于AA、低增生性MDS和PNH 均属于骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制、临床表现和生物学特性，三种疾病之间的鉴别很困难。FLAER检测与CD59相比灵敏性和特异性更高。能够早期提供更为灵敏、特异的PNH 克隆依据，在临床症状不典型、诊断不明确的疑似PNH患者，辅以FLAER检测有助于早期确诊或除外诊断。因此，FLAER高灵敏度检测PNH 克隆对这三种疾病及疾病之间的诊断鉴别及了解临床过程、预后及转归具有一定的意义。
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