大肠杆菌表达人IL?21融合蛋白的纯化和抗原性分析

时间:2020-11-12 11:39:49 论文范文 我要投稿

大肠杆菌表达人IL?21融合蛋白的纯化和抗原性分析

                     作者:付强 钱冬萌 闫志勇 侯伟 王斌

【摘要】  目的 在大肠杆菌中表达人IL?21编码基因,并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板,经PCR获得IL?21全基因片段。测序确认后,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。将此IL?21基因插入表达载体pGEX?4T?2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用Western Blotting作抗原性分析。结果 SDS?PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带,并获得了与理论值相符的纯化条带,在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL?2的单抗产生结合反应。结论 人IL?21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法,通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL?21蛋白与IL?2之间结构的相似性。 
【关键词】  白细胞介素21; 基因表达;免疫印迹法;重组融合蛋白质类
  [ABSTRACT]ObjectiveTo express coding gene of human interleukin?21 (IL?21) in E.coli, purify its protein, and assay its antigenicity.MethodsHuman IL?21 gene fragments were obtained from human tonsil cDNA by PCR. The coding gene for the mature N terminus of IL?21 was inserted into prokaryotic expressing vector pGEX?4T?2 and transformed into E.coli DH5α. The expressed product was purified by affinity chromatography using GST Fusion Protein Purification bead and its antigenicity analyzed by Western Blotting.ResultsInduced by IPTG, E.coli DH5α expressed the right molecular weight protein. Western Blotting test showed the protein had reaction with IL?2 monoclonal antibody.ConclusionThe vector pGEX?4T?2/IL?21 and engineering bacteria E.coli DH5α expressing IL?21 mature N terminus fusion protein is successfully constructed. By purification and Western Blotting test, the recombinant IL?21 revealed resemblant antigenicity to IL?2.
    [KEY WORDS]Interleukin?21; Gene expression; Immunoblotting; Recombinant fusion proteins
    以美国JULIA教授为首的研究小组在国际上首次构建了BaF3/IL?21R细胞系,并用此细胞系从活化的CD+3细胞中分离并鉴定了一类新的细胞因子——人白细胞介素21(IL?21)[1],此后世界范围多个实验室相继进行了相关研究。现在已知IL?21具有广泛的生物学功能,能够调节体液和细胞介导的免疫应答,刺激T、B和NK细胞的增殖、活化和分化,并且对肿瘤细胞的生长有抑制作用[2~4]。本研究构建了中国人IL?21基因编码的重组质粒,并在大肠杆菌中进行表达[5]。同时通过进一步对表达产物进行GST亲和层析纯化后,使用IL?2单克隆抗体与重组蛋白做Western Blotting抗原性分析。现将结果报告如下。
  1  材料和方法
  1.1  质粒、菌株和主要试剂
    质粒pGEX4T?2和菌株E.coli JM109、E.coli DH5α均为本室保存。PCR试剂、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pGEM?T Easy  Vector  试剂盒均购自Promega公司。DNA限制性内切酶BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 均购自Takara公司。引物均由北京赛百盛公司合成(PAGE纯化),GST Fusion Protein Purification bead 购自Amersham公司。
  1.2  IL?21全编码基因的克隆
    将经PHA刺激培养48 h的人扁桃体细胞总RNA逆转录为cDNA后,进行PCR扩增。利用T4 DNA连接酶将7.5 μL PCR纯化产物与0.5 μL T?Easy载体连接。同时,使用TSS法制备感受态大肠杆菌JM109,将连接产物转化后在涂有X?Gal和IPTG的ALB固体培养基上培养,37 ℃放置12~16 h。 通过蓝白斑法选择阴性、阳性克隆,从中提取重组质粒DNA,采用 PCR和酶切初步鉴定后,进行DNA序列测定分析。
  1.3  IL?21重组表达质粒的构建
    利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。经过纯化的PCR产物及载体pGEX4T?2同时用核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4连接酶连接,构建原核重组表达质粒。对用TSS法新鲜制备的感受态E.Coli.DH5α进行转化。对转化长出的菌落进行质粒小提,用限制性内切酶进行初步鉴定后,进行DNA序列测定分析。
  1.4  重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
    挑取单个重组成功菌落接种于5 mL Amp?LB中, 37 ℃震荡培养,当菌液吸光度达到0.4~0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌DH5菌中的表达。分别于诱导后1、2、4 h取菌液3 mL,12 000 r/min离心1 min,沉淀用SDS凝胶加样缓冲液震荡后置沸水浴5 min,稍微离心,上清移至新管,-20 ℃储存备用。同时,用DH5α宿主菌和未诱导的含重组质粒的DH5α菌,以及诱导的含pGEX4T?2质粒的DH5α菌样品作对照行SDS?PAGE。
  1.5  表达蛋白的纯化和Western Blotting分析
    根据37 ℃时蛋白表达情况,降低细菌的诱导温度到23 ℃进行大体积低温诱导3 h。收集菌液,经离心后,将菌斑用适当体积的PBS液洗涤两次后再次重悬,冰浴下超声裂解细菌。4 ℃,14 000 r/min离心10 min分离上清。将上清中加入GST Fusion Protein Purification bead震荡30 min纯化浓缩上清中的蛋白。将诱导的菌体、纯化的融合蛋白进行SDS?PAGE电泳,电泳后用Bio?Rad公司的电转仪将蛋白转至PVDF膜上。电转结束后将膜在丽春红染液中染色,用铅笔标记出蛋白Marker。然后,参照分子克隆实验操作。一抗为IL?2的单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
  2  结 果
  2.1  目的基因的PCR扩增
    PCR扩增的IL?21全编码基因长为642 bp,其中成熟N端编码基因长为396 bp。同DNA标准相对分子质量参照物相比,PCR扩增产物的大小与预测的结果一致(图1)。
  2.2  原核重组表达质粒的鉴定
    经PCR扩增出的IL?21成熟肽的编码基因片段和鉴定重组成功的质粒经双酶切后同时进行电泳,可见酶切产物和PCR扩增条带大小与理论