大剂量维生素C对外周血细胞活性的影响
作者：薛美兰 张秀珍 马爱国 姜秀波 张金玉
【摘要】 目的 观察大剂量维生素C（VC）对外周血淋巴细胞增殖活性、抗DNA氧化损伤能力以及红细胞膜流动性的影响。方法 将48只Wistar大鼠随机分为对照组、A、B、C共4组，分别给予含VC为0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的饲料，实验期为8周。实验结束后无痛处死动物并取血，测定血浆VC、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，红细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）活性、红细胞膜流动性、淋巴细胞增殖活性，单细胞凝胶电泳计数彗星细胞测量DNA氧化损伤水平。结果 与对照组比较，A组血浆SOD活性明显增高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），血浆MDA含量明显降低(F=4.176,q=4.23，P<0.05)，红细胞膜流动性和外周血淋巴细胞增殖活性均明显增高（F=2.278～2.763,q=3.67-3.84，P<0.05）；C组的血浆VC含量明显升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD和红细胞膜GSH?Px活性明显降低（F=2.987、3.478,q=3.68～4.13，P均<0.05），MDA含量明显增高（q=4.08，P<0.05）。10 μmol/L H2O2诱发DNA损伤B组和C组较对照组均加重（F=4.137,q=3.94、4.25，P<0.05）。结论 较高剂量VC（2 000 mg/kg）可明显增高大鼠机体的抗氧化损伤水平，改善红细胞膜流动性，提高淋巴细胞的增殖活性；当VC剂量超过5 000 mg/kg时，反而会加重淋巴细胞的DNA氧化损伤。
【关键词】 抗坏血酸；超氧化物歧化酶；膜流动性；淋巴细胞活化；DNA损伤
维生素C（VC）是一种水溶性维生素，具有抗氧化活性。一般认为VC是水溶性的，不能在体内蓄积，摄入较高剂量不会对机体产生危害。已知超大剂量服用VC会产生副作用，包括胃胀气、腹泻、呕吐等。有一项体外研究指出，VC抗氧化作用与其剂量有密切关系[1]，过大剂量的VC（0.5 mmol/L）可能增加细胞DNA对H2O2或其他有害物质损害的敏感性。目前，健康机体摄入高剂量的VC是否有不良影响尚无定论。本实验通过体内实验对大鼠进行超出生理需要量数倍的大剂量VC干预，观察大剂量VC对健康幼年大鼠外周血淋巴细胞增殖活性和抗DNA氧化损伤能力以及红细胞膜流动性的影响及其可能机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物分组及处理
幼年Wistar大鼠48只，雌雄各半，分笼饲养，体质量80～100 g，由山东大学实验动物中心提供。基础饲料适应性喂养1周后，随机分为对照组、A、B、C共4组，每组12只，分别给予含VC为0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的饲料（在基础饲料中添加VC并充分混匀，低温压制并经循环风自然干燥，饲料制成后立即放入-20 ℃冰箱中保存）。各组动物自由饮水，环境温度维持在23～25 ℃。实验期为8周。基础饲料的成分组成（%）：面粉20，玉米粉30，豆面15，麸皮25，鱼粉5，骨粉1，食盐1，酵母粉1，色拉油2，核黄素0.004，鱼肝油0.04。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 血样采集 大鼠处死前12 h撤掉食物，应用200 g/L的乌拉坦麻醉后经腹主动脉取血，留取800 μL红细胞，按低渗一步溶血法[2]制备红细胞膜备用，并同时分离淋巴细胞。其余全血离心获取血浆置于-20 ℃冰箱中保存待测。
1.2.2 血浆VC测定 采用2，4?二硝基苯肼法。
1.2.3 血浆超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及红细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）活性测定SOD活性测定采用羟胺法，GSH?Px活性测定采用DTNB直接法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法。SOD、GSH?Px、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2.4 红细胞膜流动性测定 采用Lowry法测蛋白，调整膜蛋白的浓度为200～800 mg/L, DPH荧光标记红细胞膜。应用美国PE公司LS?50型荧光分光光度计测荧光偏振度，Ex 362 nm，Em 432 nm，狭缝10 nm，温度25 ℃，按文献[4]公式计算荧光偏振度P值和微黏滞度η值。
1.2.5 外周血淋巴细胞增殖活性的测定 采用ELX 2800酶标仪(美国BioTek公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定。
1.2.6 DNA氧化损伤分析 采用单细胞凝胶电泳或彗星电泳技术检测[3]，取新鲜抗凝血30 μL，经分离获取淋巴细胞，分别应用0、10、25 μmol/L的H2O2氧化处理5 min。将DAPI荧光染色的细胞核在荧光显微镜下观察100个“彗星”细胞，根据拖尾的长度衡量DNA链断裂损伤程度（AU）[4]。
1.3 统计学处理
采用SPSS 11.0和PPMS 1.5[5]统计软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 各组血浆VC、SOD、MDA含量和红细胞膜GSH?Px活性比较
与对照组比较，A组血浆SOD活性升高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），MDA含量显著下降（F=4.176,q=4.23，P<0.05）；C组的血浆VC含量明显升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD活性明显下降（q=4.13，P<0.05），MDA含量明显升高（q=4.08，P<0.05），红细胞膜GSH?Px 活性明显下降（F=3.475,q=3.68，P<0.05）。与A组比较，B组和C组MDA含量明显升高（q=4.73～5.20，P<0.01），SOD活性明显下降（q=3.58～3.65，P<0.05）；C组的血浆VC含量明显升高（q=4.51，P<0.01），红细胞膜GSH?Px 活性明显下降（q=3.84，P<0.05）。 见表1。
表1 各组血浆VC、SOD、MDA含量和红细胞膜GSH?Px活性比较（略）
与对照组比较，F=2.987～4.176，*q=3.68～4.63，P<0.05；与A组比较，#q=3.58～5.20，P<0.05
2.2 各组大鼠淋巴细胞增殖活性的比较
对照组淋巴细胞增殖活性为0.042±0.036，A组为0.111±0.115，B组为0.049±0.059，C组为0.041±0.047。与对照组比较，A组的外周血淋巴细胞增殖活性明显升高（F=2.278，q=3.67，P<0.05）；与A组比较，C组的淋巴细胞增殖活性明显降低（q=4.19，P<0.05）。
2.3 各组大鼠红细胞膜流动性的比较
与对照组比较，A组红细胞膜P、η值显著升高（F=2.458、2.763，q=3.84、4.23，P<0.05）；与A组比较，C组红细胞膜P、η值显著下降（q=4.61、6.54，P<0.01）。见表2。