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人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定
【摘要】 目的 获得纯化人突变CD59(hmCD59)蛋白，制备其特异性抗体，对纯化产物进行鉴定。方法 将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒,运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDS?PAGE检测hmCD59的表达情况，表达产物经ANTI?FLAG M2 Affinity Gel纯化后制备抗血清，以此抗血清鉴定纯化产物。结果 hmCD59在CHO细胞获得表达，ANTI?FLAG M2 Affinity Gel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白，hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论 从真核细胞获得了电泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白，为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。
【关键词】 人突变CD59 真核细胞表达 纯化 抗原性
［ABSTRACT］ObjectiveTo obtain purified human mutant CD59 (hmCD59) protein and to identify the purified product with specific antiserum against hmCD59 protein.MethodsThe recombinant pALTER plasmid containing hmCD59 cDNA was transfected into CHO cells with pcDNA3 by lipofectamine. Expression of hmCD59 on CHO cells was detected by SDS?PAGE. The recombinant protein was purified by ANTI?FLAG M2 Affinity Gel. The antiserum was prepared with the purified hmCD59 and used to identify the purified hmCD59.ResultshmCD59 protein was purified by ANTI?FLAG M2 Affinity Gel. Furthermore, hmCD59 had specific reactivity with mouse anti?hmCD59 antiserum.ConclusionThe purified hmCD59 protein has been obtained successfully, which lays the foundation for preparing antibody, further functional study and clinical application of hmCD59.
［KEY WORDS］human mutant CD59; eukaryotic cells expression; purification； antigenicity
CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固膜蛋白,相对分子质量较小,只有 20 000左右,在补体活化通路的不同阶段限制补体活化，成为攻膜复合体（MAC）形成的关键抑制物,从而保护自身正常的组织细胞免受补体损伤［1］。国内外研究显示，人CD59糖化后失去抑制MAC的功能［2］，突变人CD59(hmCD59)在高糖环境下更加易于糖化失活，抗补体活性更快降低［3］ ，MAC沉积增加，内皮释放生长因子，引发糖尿病病人血管增殖［4］。人类糖尿病血管并发症发生的潜在机制仍然不十分清楚，尤其是hmCD59与糖尿病并发症的相关性鲜有报道。本研究报道hmCD59蛋白的表达、提取、纯化及抗原性鉴定，为下一步制备抗hmCD59单克隆抗体并对其进行临床应用研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株与细胞株 质粒hmCD59?PALTER由本室构建保存。pcDNA3由美国哈佛大学提供。CHO细胞株由本室保存。
1.1.2 主要试剂 EcoRⅠ购自宝生物大连有限公司。RPMI 1640培养基购自HyClone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。G418选择性抗生素购自于Amresco公司。LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。ANTI?FLAG M2 Affinity Gel Freezer?Safe为Sigma?Aldrich公司产品。Vivaspin 2超滤浓缩离心管为Sartorius公司产品。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品。HRP标记的羊抗小鼠IgG为北京中山生物技术有限公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 质粒hmCD59?PALTER的鉴定 将hmCD59?PALTER质粒经EcoRⅠ酶切鉴定并经上海生物工程公司测序确认。
1.2.2 hmCD59在CHO细胞中的表达 重组质粒hmCD59?PALTER对CHO细胞的转染,参照LipofectamineTM 2000的说明书进行。转染后24 h将细胞作1∶10稀释后传代,48 h后加入选择培养液(含有800 mg/L的G418)筛选阳性克隆2周，挑取单个克隆,继续抗性筛选2周,其阳性克隆的后续培养始终在G418维持剂量(400 mg/L)下进行。收集生长状态良好的阳性CHO细胞，裂解后离心取上清以SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS?PAGE）鉴定蛋白的表达。
1.2.3 目的蛋白hmCD59的纯化 获取生长良好的107～108个转染CHO细胞 ，加入细胞裂解液(含50 mmol/L Tris HCl,pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA,体积分数0.01的TRITONX?100)10 mL,冰上振荡裂解30 min后低温离心取上清待用。将ANTI?FLAG M2 Affinity Gel装柱并静置，待填料完全沉降后，用TBS （其中含50 mmol/L Tris HCl,150 mmol/L NaCl, pH 7.4)冲洗，连续加3次柱体积的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)洗胶，再以TBS在4 ℃平衡树脂。加入总蛋白提取物，在重力作用下多次流经亲和柱，保持 4 ℃，控制流量为1 mL/min,再用10～20个柱容积的TBS冲洗，去掉未结合的杂蛋白，经磺硫酸检测无蛋白流出。然后用6个1 mL的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)进行洗脱，分别收集入6个含有20 μL 1.0 mol/L Tris (pH 8.0)的管中。
1.2.4 hmCD59的SDS?PAGE鉴定 SDS?PAGE中使用120 g/L的分离胶和50 g/L的浓缩胶。将收集的洗脱峰蛋白2 mL装入Vivaspin 2超滤浓缩离心管中，3 000 r/min离心12 min进行浓缩至浓度为1 g/L。取20 μL浓缩后样品与等体积2×上样缓冲液混匀后，在沸水浴中加热5 min,上样，起始电压为70 V。当样品移出浓缩胶与分离胶的分界处时，加大电压到100 V至电泳终了，经考马斯亮蓝染色后观察结果。
1.2.5 小鼠抗hmCD59抗血清的制备 将hmCD59与等体积弗氏完全佐剂制成乳化剂，以10 μg剂量多点注射于2只6～8周龄雌性BALB/C小鼠的背部，21 d后以同样剂量的hmCD59与弗氏不完全佐剂乳化进行第一次加强免疫，背部皮下多点注射，14 d后以同样方法进行第2次加强免疫。10 d后断尾采血制备抗血清。将hmCD59蛋白进行稀释（2、10 mg/L）后包被，均设3个复孔。以酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗血清的效价，免疫前小鼠血清作为阴性对照。
2 结 果
2.1 质粒hmCD59?PALTER的鉴定
以EcoRⅠ对hmCD59?PALTER进行酶切，获得1条496 bp的电泳带,与插入的目的基因片段大小相一致（图1）。测序结果表明, hmCD59?PALTER59含有突变的CD59全长cDNA序列。
2.2 目的蛋白hmCD59的表达
已转染hmCD59?PALTER的CHO细胞SDS?PAGE分析显示，在相对分子质量为20 000处出现条带（图2），同预期结果一致。
2.3 目的蛋白hmCD59的纯化
将转染CHO细胞总蛋白提取物经过ANTI?FLAG M2 Affinity Gel亲和层析纯化，收集洗脱液，浓缩后经SDS?PAGE并用考马斯亮蓝染色显示，得到电泳纯hmCD59蛋白（图3）。
2.4 抗hmCD59抗血清的制备及鉴定
以纯化的hmCD59为免疫原，免疫2只BALB/C小鼠，在2次加强免疫后取血制备抗血清，2只小鼠的抗血清效价均在1∶10 000以上，免疫前血清与hmCD59无特异性反应，表明获得了抗hmCD59的抗血清。
3 讨 论
糖尿病血管增殖症是严重危害糖尿病病人的并发症，明确糖尿病血管增殖症的发病机制并有效防治，是目前糖尿病诊断及治疗领域中的重点。研究证实，CD59作为一种补体调节蛋白，可阻止MAC形成，对于保护自身细胞免受补体损伤起到了关键的作用［ 5,6］。对CD59结构及功能的研究揭示，人类CD59分子存在易于糖基化位点K41?H44［7］，糖化人CD59失去了MAC的抑制功能［2］。近年来，有研究表明，人CD59糖基化位点突变后在高糖环境下更加易于糖基化而失去抗补体活性［3］，致使MAC大量沉积于血管内皮，促使血管内皮释放成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子，刺激成纤维细胞、平滑肌细胞过度增殖，从而发生血管增殖症及硬化症［4］。因此,有学者推测糖尿病病人体内存在CD59基因突变，但目前国内外尚无能够用于检测抗hmCD59的抗体，hmCD59的提取、纯化及鉴定国内外也尚未见报道。
【参考文献】
［1］XUEBIN Q, ALLISON G, NICOLE K, et al. Glycation inactivation of the complement regulatory protein CD59：a possible role in the pathogenesis of the vascular complications of human diabetes［J］. Diabetes, 2004,53(10):2653?2661.
［2］JUAN A, JUDITH H, RUDOLF F, et al. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes［J］. PNAS, 2000,97:5450?5455.
［3］张艳丽，高美华. 人CD59基因的突变和表达及其活性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2005，21（2）：151?154.
［4］BENZZAQUEN L R, NICHOLSON?WELLER A, HALPERIN J A. Terminal complement proteins C5b?9 release basic fibroblast growth factor and platelet?derived growth factor from endothelial cells［J］. J Exp Med, 1994,179:985?992.
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