人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定
2.2 目的蛋白hmCD59的表达
已转染hmCD59?PALTER的CHO细胞SDS?PAGE分析显示，在相对分子质量为20 000处出现条带（图2），同预期结果一致。
2.3 目的蛋白hmCD59的纯化
将转染CHO细胞总蛋白提取物经过ANTI?FLAG M2 Affinity Gel亲和层析纯化，收集洗脱液，浓缩后经SDS?PAGE并用考马斯亮蓝染色显示，得到电泳纯hmCD59蛋白（图3）。
2.4 抗hmCD59抗血清的制备及鉴定
以纯化的hmCD59为免疫原，免疫2只BALB/C小鼠，在2次加强免疫后取血制备抗血清，2只小鼠的抗血清效价均在1∶10 000以上，免疫前血清与hmCD59无特异性反应，表明获得了抗hmCD59的抗血清。
3 讨 论
糖尿病血管增殖症是严重危害糖尿病病人的并发症，明确糖尿病血管增殖症的发病机制并有效防治，是目前糖尿病诊断及治疗领域中的重点。研究证实，CD59作为一种补体调节蛋白，可阻止MAC形成，对于保护自身细胞免受补体损伤起到了关键的作用［ 5,6］。对CD59结构及功能的研究揭示，人类CD59分子存在易于糖基化位点K41?H44［7］，糖化人CD59失去了MAC的抑制功能［2］。近年来，有研究表明，人CD59糖基化位点突变后在高糖环境下更加易于糖基化而失去抗补体活性［3］，致使MAC大量沉积于血管内皮，促使血管内皮释放成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子，刺激成纤维细胞、平滑肌细胞过度增殖，从而发生血管增殖症及硬化症［4］。因此,有学者推测糖尿病病人体内存在CD59基因突变，但目前国内外尚无能够用于检测抗hmCD59的抗体，hmCD59的提取、纯化及鉴定国内外也尚未见报道。 本实验将重组的hmCD59?PALTER质粒转染CHO细胞，长期实验及鉴定表明,hmCD59可以在CHO细胞稳定表达。通过培养表达hmCD59的CHO细胞，并将其总蛋白提取物用亲和层析法进行纯化，经鉴定表明得到了电泳纯的hmCD59蛋白。本研究设计具有以下特点：①选用CHO这种低表达非特异性蛋白的哺乳动物细胞系用来进行重组质粒的转染，保证了特异性目的蛋白稳定表达。②采用Sigma?Aldrich公司的ANTI?FLAG M2 Affinity Gel进行纯化，国内尚无报道。本产品通过氢键将纯化的单克隆抗体共价结合在琼脂糖上，可用于FLAG融合蛋白的纯化，其结合FLAG肽是非钙依赖性的。ANTI?FLAG M2 Affinity Gel具有手工操作方便、化学物理稳定性强、可再生重复利用、特异性强、回收率高等优点，由于本实验中hmCD59?PALTER重组质粒设计含有FLAG序列，利用细胞表达FLAG与亲和胶抗FLAG单克隆抗体特异性结合可获得高纯度的FLAG融合蛋白。③以纯化的hmCD59为免疫原制备了高效价的抗血清，说明获得的hmCD59具有较强的抗原性。鉴于hmCD59在人类糖尿病血管并发症发生及诊断中的重要性，本文获得了电泳纯的hmCD59蛋白及其抗血清，为下一步制备其单克隆抗体，进一步明确人突变CD59与人类糖尿病血管并发症之间的分子机制、潜在关系及临床糖尿病的诊断奠定了坚实的基础。
【参考文献】
［1］XUEBIN Q, ALLISON G, NICOLE K, et al. Glycation inactivation of the complement regulatory protein CD59：a possible role in the pathogenesis of the vascular complications of human diabetes［J］. Diabetes, 2004,53(10):2653?2661.
［2］JUAN A, JUDITH H, RUDOLF F, et al. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes［J］. PNAS, 2000,97:5450?5455.
［3］张艳丽，高美华. 人CD59基因的突变和表达及其活性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2005，21（2）：151?154.
［4］BENZZAQUEN L R, NICHOLSON?WELLER A, HALPERIN J A. Terminal complement proteins C5b?9 release basic fibroblast growth factor and platelet?derived growth factor from endothelial cells［J］. J Exp Med, 1994,179:985?992.
［5］QIN X, KRUMREI N, GRUBISSICH L, et al. Deficiency of the mouse complement regulatory protein mCd59b results in spontaneous hemolytic anemia with platelet activation and progressive male infertility［J］. Immunity, 2003,18:217?227.
［6］BROOIMANS R A. Relative roles of decay?accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement mediated lysis［J］. Eur J Immunol, 1992,22:3135?3140.
［7］HALPERIN J A, TARATUSKA A, RYNKIEWICZ M A, et al. Transient changes in erythrocyte membrane permeability are induced by sublytic amounts of the complement membrane attack complex(C5b?9)［J］. Blood, 1993,81:200.
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