脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

时间:2021-03-14 11:43:11 论文范文 我要投稿

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

                                  作者:毕春霞,武静,张德坤,苏维奇,刘成玉,闫志勇

【关键词】  脑脊髓液;细菌;寡核苷酸芯片;寡核苷酸序列分析

  [摘要]目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据脑脊液标本中常见病原菌16S rRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物,制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针,以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针,将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增,扩增过程中用生物素标记;将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交,检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论 建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。

  [关键词] 脑脊髓液;细菌;寡核苷酸芯片;寡核苷酸序列分析

  [ABSTRACT]ObjectiveTo develop a rapid detection method for common pathogens in cerebrospinal fluid (CSF). Me- thodsAccording to the conservative and variable regions in bacterial 16S rRNA genes, a pair of universal primers that can amplify rDNA of all bacteria were designed. Ten kinds of specific probes were designed by Premier software. Probes for identification were tailed and then spotted onto a nylon membrane. DNA were isolated from each pathogen, and subjected to UP- PCR to amplify tar-get fragments, which were labeled with bio-16-dUTP at the same time. All these fragments were denatured, and then hybridized to all probes on nylon membrane and visualized by AKP labeled avidin. ResultsThe pathogens reacted only to their corresponding probe fixed on nylon membrane with high specificity. ConclusionThe newly established 16S rRNA oligo-chip can specifically screen out the pathogens in CSF.

  [KEY WORDS]cerebrospinal fluid; bacteria; macroarraying; oligonucleotide array sequence analysis

  细菌性脑脊髓膜炎是一种发病急、病死率高的常见的中枢神经系统疾病,需要及时有效的治疗,而其有效治疗主要取决于对脑脊液中感染的病原菌进行快速而准确的检测和鉴定。目前临床实验室采用的传统细菌培养鉴定方法敏感性低,检测周期长,且受抗生素应用、病原菌自身生理条件等各方面的限制,不能满足临床快速诊断的要求[1]。近年来发展起来的基因芯片技术以其高通量、快速等优点为解决上述问题提供了一条新的途径[2,3];但该技术成本高,需要点样仪和扫描仪等特殊仪器设备,因而在临床实验室的实际操作中的应用还比较局限。而以硝酸纤维膜和尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金 显色等简便检测手段则方便了寡核苷酸芯片技术在各领域的应用[4]。本研究根据基因芯片的基本原理,并结合临床实验室的具体要求,探讨建立一种简易的检测脑脊液标本感染病原菌的寡核苷酸芯片(又称宏观矩阵)。现报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 细菌菌株 根据脑脊液病原菌的流行病学调查结果,初步选取以下7种常见的病原菌进行研究。大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、脑膜炎奈瑟菌(ATCC 13077)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、绿脓假单胞菌(ATCC 25668),以及对照菌白色念珠菌(ATCC 14053)标准菌株均由中国药品与生物制品鉴定所提供,肺炎链球菌、产单 核李斯特菌等标准菌株或临床分离菌株为本室保存。
 
  1.2 脑脊液模拟感染标本的制作 将上述细菌接种至响应液体培养基中,37 ℃培养至对数生长期,取一定量菌液与经验证无菌的脑脊液混均后作为脑脊液模拟感染标本。

  1.3 引物及探针 参照文献[5,6],在GenBank查得多种常见细菌16S rRNA基因序列,用DNAstar软件进行分析比较,在保守区用PrimerPremier软件各寻找一段大多数常见细菌共有保守序列作为通用引物。根据该上、下游引物之间的变异区序列分别设计各特异性探针。设计的'探针主要包括:所有细菌的通用探针,革兰阳性(G+ )菌的通用探针,革兰阴性(G- )菌的通用探针,肠杆菌科的属特异性探针、绿脓假单胞菌特异性探针、金黄色葡萄球菌的特异性探针、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的特异性探针、肺炎链球菌的特异性探针,以及产单核李斯特菌的特异性探针等共11种。

  1.4 寡核苷酸芯片的制备 取上述各探针(50 μmol/L)4 μL,在20 μL的反应体系中用末端转移酶TDT(美国Promega公司)以dTTP为底物在3′端加尾,取加尾后的探针各0.5 μL按照固定顺序点于尼龙膜上(Zeta-Probe,Bio-Rad公司), 80 ℃固定2 h;用缓冲液( 5× SSPE, SDS)漂洗去除未连接的寡核苷酸探针,干燥后保存备用。
  
  1.5 细菌DNA提取 取制备的各脑脊液模拟感染标本,应用基因组DNA提取试剂盒(Wizard Genomic DNA Purifica-tion Kit,美国Promega公司)提取细菌DNA。

  1.6 UP-PCR扩增与Biotin标记 参照文献[6]的方法并进行改进。PCR混合液( 50 μL )组成如下:模板2.0 μL,Taq DNA 聚合酶 0.5 μL ,MgCl 22.5 mmol/L,dATP、dCTP、dGTP各200 nmol/L,dTTP 135 nmol/L,Biotin-16-dUT 65 nmol/L,上下游引物各0.4 μmol/L。扩增条件:94 ℃预变性 6 min后,94 ℃ 45 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s共30个循环,最后72 ℃延伸10 min。取PCR产物琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

  1.7 分子杂交与检测 将PCR阳性产物100 ℃变性10 min后立刻放冰浴1 min;然后加入到1.5 mL杂交液中混匀,加入制备的寡核苷酸芯片50 ℃杂交3 h;杂交完毕后, 用洗涤液( 2×SSC )室温下漂洗 5 min ;然后依次用2× SSC室温下、0.1×SSC 37 ℃和65 ℃振荡漂洗各15 min。显色时先加入30 g/L的BSA室温下作用15 min,弃去液体;然后加适量碱磷酶标记链霉亲合素溶液室温作用10 min,弃去SA-AP液,用洗膜缓冲液室温洗3~5次,最后将寡核苷酸芯片置一新杂交槽中,加入NBT/BCIP底物工作液,室温下避光显色。