大鼠脑干DVC区注射ghrelin对弓状核NPY mRNA及AgRP m

时间:2021-05-02 18:21:34 论文范文 我要投稿

大鼠脑干DVC区注射ghrelin对弓状核NPY mRNA及AgRP mRNA表达的影

                   作者:陈新科 李清春 陈 蒋正尧 管洪在

【摘要】  目的 探讨脑干迷走神经复合体(DVC)区微量注射ghrelin对摄食的影响及其可能机制。方法 72只雄性SD大鼠随机分成给药组和正常对照组,每组36只大鼠,行DVC区埋管手术,术后恢复7 d。7 d后给药组大鼠DVC区微量注射20 pmol的ghrelin,正常对照组大鼠DVC区微量注射等体积生理盐水。两组分别于给药后1、2、3 h取大鼠下丘脑提取RNA,应用荧光定量PCR方法检测大鼠下丘脑弓状核神经肽Y(NPY)及刺鼠色蛋白相关蛋白(AgRP)mRNA的表达情况。结果 给药组大鼠给药后1、2、3 h下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA的表达水平均明显高于正常对照组,差异有显著性(t=2.79~9.12,P<0.05)。给药组大鼠给药后2 h下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA的表达水平明显高于给药后1 h及3 h组(F=16.55、10.45,q=3.89~4.45,P<0.05),但给药后1 h与3 h下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA的表达水平比较差异无显著性(P>0.05)。结论 作用于大鼠DVC区的ghrelin可能通过下丘脑弓状核NPY、AgRP神经通路促进摄食活动。 
【关键词】  Ghrelin;下丘脑;弓状核;神经肽Y;刺鼠色蛋白相关蛋白;大鼠
hrelin是生长素促分泌素受体(GHS?R)的内源性配体,由28个氨基酸组成,在饮食的控制中发挥着重要的作用。已有研究表明,外周和脑室注射ghrelin都可使摄食量明显增加。尽管GHS?R分布在脑中枢的多个区域,但目前绝大多数研究认为,无论中枢还是外周ghrelin促进摄食作用都是通过下丘脑弓状核神经肽Y(NPY)、 刺鼠色蛋白相关蛋白(AgRP)神经元上的GSH?R介导的[1]。KIMBERL等[2]在大鼠第三脑室和第四脑室注射ghrelin后明显地增加了下丘脑弓状核NPY的表达,但是第三脑室和第四脑室相互交通,注射在任何一个脑室的药物均有可能弥散到另一个脑室,从而影响结果的`分析。最近ZIGMAN等[3]用原位杂交法的研究结果表明,在大鼠迷走神经复合体(DVC)区的3个组成部分:孤束核、迷走神经运动背核和最后区均有GHS?R的表达。FAUL?CONBRIDGE等[4]在大鼠右侧DVC区注射10 pmol ghrelin获得相当于下丘脑弓状核注射30 pmol的摄食增加反应,提示在中枢ghrelin诱发的多食反应中,DVC可能和下丘脑弓状核同样重要。本文采用荧光定量PCR的方法检测大鼠DVC区微量注射ghrelin 后下丘脑NPY mRNA及AgRP mRNA表达的变化,进而探讨脑干DVC区微量注射ghrelin促进摄食的可能机制。现将结果报告如下。
  1  材料和方法
  1.1  动物与分组
    
  健康成年雄性SD大鼠72只,体质量250~350 g,由山东中医药大学实验动物中心提供。随机分成给药组和正常对照组,每组又根据注射后检测间隔时间的不同分为3个亚组,即1 h组、2 h组和3 h组,每个亚组12只大鼠。给药组大鼠DVC区埋管后微量注射20 pmol ghrelin,正常对照组DVC区以相同方法埋置套管,微量注射等体积生理盐水。
  1.2  主要试剂与仪器
    
  Ghrelin 购自美国肽公司(American Peptide Company, INC),生理盐水溶解。TRIzol 购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自MBI公司。 SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司。荧光定量PCR仪为ABI 7500。立体定位仪为日本Narishige公司生产。紫外线分光光度计为Eppendorf Biophotometer公司生产。引物由上海生工合成,序列如下:内参照β?actin 上游引物5′?CCATCCAGGCTGTGTTGTCC?3′,下游引物5′?GCTTCTCTTTAATGTCACGCACG?3′;PCR产物长度为243 bp。NPY 上游引物5′?TGTGGACTG?ACCCTCGCTCTAT?3′,下游引物5′?TGTAGTGT?CGCAGAGCGGAGTA?3′;PCR产物长度为139 bp。AgRP上游引物5′?AGCTTTGGCAGAGGTGCTA?GATC?3′,下游引物5′?TGCCAGTACCTAGCTTGCGG?3′;PCR产物长度为173 bp。
  1.3  实验方法
  1.3.1  DVC区埋置套管  SD大鼠在(22±1)℃室温下,保持12 h白天、12 h黑夜循环的环境下饲养,自由饮水和进食。手术当天,大鼠用80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉,俯卧位,固定在立体定位仪上,头部正中切口,剥离骨膜,使前后囟位于同一水平面。用三棱针在颅骨表面钻孔,清除脑膜,参照大鼠脑图谱[5],将长15 mm、内径0.3 mm、外径0.4 mm的自制不锈钢套管垂直置入右侧DVC区(前囟后13.8 mm,正中线旁开0.4 mm,颅骨表面下8.5 mm),将一小螺丝钉固定于颅骨表面,用502胶和自凝牙托粉固定套管,并置入不锈钢内芯防止阻塞[6]。
  1.3.2  埋管位置鉴定  分组实验前先行埋管位置准确性的鉴定。大鼠手术后恢复7 d,分笼饲养,每天腹腔注射2万单位青霉素预防感染。经套管微量注射0.2 μL 滂胺天蓝,然后心脏灌流生理盐水和40 g/L甲醛后,取脑,以40 g/L 蔗糖?甲醛溶液固定,50 μm冠状冷冻切片,观察DVC置管定位准确性。重复此实验,直至连续8只大鼠均能准确定位。
  1.3.3  RNA的提取  大鼠手术后恢复7 d,给药组大鼠微量注射20 pmol ghrelin,2 min内注完,留针10 min;正常对照组同样方法给予等体积生理盐水。给药和测定均在每天的上午10:00开始,实验前3 d即开始模拟注射操作,以减少应激反应。所有动物均自由摄食。给药后1、2、3 h分别取大鼠下丘脑,用Trizol Reagent常规方法提取总RNA,Eppendorf紫外线分光光度计测定RNA浓度和纯度,并进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳,观察RNA完整性。
  1.3.4  cDNA合成和荧光定量PCR反应  取5 μg总RNA,以Oligo dT为引物,按试剂盒说明书进行逆转录反应得到cDNA备用。定量PCR前将样品稀释1 000倍,反应体系为25 μL,含cDNA 2.5 μL,SYBR Green Mix 12.5 μL,10 μmol/L 上下游引物各1 μL,RNase?free Water 8 μL。反应条件:95 ℃60 s预变性;95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s共40个循环。