简述菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化试验
摘要：为提高黑曲霉(Aspergillusniger)A24诱变菌株产菊粉酶的活力，采用单因子试验方法对该菌株的最佳产酶条件进行了优化。结果表明：该菌株在以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4为复合氮源的培养基中，初始 pH值6.0，30℃培养72h的条件下，所得的发酵液中酶活力最高，达到35.21U/mL，比优化前提高了18%，表明该菌株有一定的应用潜力。
关键词：黑曲霉;菊粉酶;酶活力;发酵条件;优化
传统果糖的生产一般是由淀粉通过葡萄糖的异构化取得，该法工艺复杂、成本较高、果糖含量低。因此，人们一直在寻求一种廉价的新糖源和生产果糖的方法。其中菊粉酶(Inulinase或Inulase)主要催化水解菊粉中的β-2，1呋喃果糖苷键，由于能在温和条件下水解菊粉产生果糖(70%以上)和少量葡萄糖，只需一步酶解过程，工艺简单，生产成本低，可直接制备超高果葡糖浆，已成为果糖工业化生产的主要酶制剂，为低聚果糖的生产提供了一个很好的解决办法。但来源于植物的菊粉酶底物专一性较强，仅作用于菊粉;由微生物产生的菊粉酶大都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷键的多种糖类，如菊糖、蔗糖和棉子糖等[1]。其中霉菌具有所产菊粉酶的最适温度较高、热稳定性好、适宜偏酸性的环境等特点而倍受关注。由潍坊学院生命科学学院实验室所保存的黑曲霉(Aspergillusniger)A24诱变菌株是从菊芋根际周围土壤中筛选出的一株产菊粉酶、又经过多轮紫外线诱变获得的菊粉酶产量较高的.菌株。该试验在此基础上，对其发酵条件进一步优化，以期获得更高的产菊粉酶活力，为进一步研究菊粉酶的生产以及生产应用提供理论基矗
1、材料与方法
1.1供试材料
黑曲霉(Aspergillusniger)A24诱变菌株，由潍坊学院生命科学学院实验室保存。菊芋(HelianthustuberosusL.)采自潍坊市郊区。菊芋汁参照前人研究方法进行制备[2]。
1.2发酵培养条件及发酵液的制备
取0.1mL黑曲霉孢子悬液，接入50mL的YJ(初始培养条件：菊粉2%，酵母膏0.3%，(NH4)2HPO41%，初始pH值6.0)发酵培养液中(250mL三角瓶)，在不同条件下进行发酵培养。
1.2.1不同碳源对产菊粉酶的影响。选择碳源分别为2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，将黑曲霉A24诱变菌种接入到不同碳源的培养基中，调节各培养基初始pH值为6.0，在30℃、120r/min的条件下培养72h，将各处理的发酵液经8000r/min离心10min后，收集上清液，分别测定酶活力。并选择出最优碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同浓度的该最优碳源对产菊粉酶的活力影响。
1.2.2不同氮源对产菊粉酶的影响。用3%的菊芋汁作碳源，以不同种类的复合氮源(有机和无机)制备的培养基发酵培养3d后，测定其发酵液中菊粉酶活力，确定最佳有机氮源;在确定最佳有机氮源为牛肉膏、无机氮源为(NH4)2HPO4的基础上，进行有机氮源和无机氮源最佳配比试验。以牛肉膏和(NH4)2HPO4做复合氮源发酵试验，取质量浓度分别为1%、2%、3%的牛肉膏和质量浓度分别为0.3%、0.5%、0.8%的(NH4)2HPO4进行复合。调培养基初始pH值为6.0，于30℃，发酵培养3d，将各处理的发酵液经8000r/min离心10min后，收集上清液，分别测定酶活力。
1.2.3培养基初始pH值对产菊粉酶的影响。设培养基初始pH值分别为3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、(CNH4)2HPO4为复合氮源，于30℃条件进行发酵培养3d。将各处理的发酵液经8000r/min离心10min后，收集上清液，分别测定酶活力。
1.2.4发酵温度对产菊粉酶的影响。以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4为复合氮源、初始pH值6.0的发酵培养基，对黑曲霉A24诱变菌株分别在24、26、28、30、32℃下进行发酵培养72h，将各处理的发酵液经8000r/min离心10min后，收集上清液，分别测定酶活力。
1.2.5发酵时间对产菊粉酶的影响。以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4为复合氮源，培养基初始pH值为 6.0，30℃下分别发酵24、48、72、96、120h，每隔24h取样。将各处理的发酵液经8000r/min离心10min后，收集上清液，测定酶活力。
1.3发酵液中还原糖含量及菊粉酶的活力测定
采用3，5-二硝基水杨酸法测定发酵液中还原糖的含量，在540nm波长处测定吸光度值，根据葡萄糖的标准曲线，求得还原糖的含量;酶活力定义为在规定反应条件下每分钟转化底物生成1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U/mL)，按照Pessoni等人报道的研究方法测定菊粉酶活力 。
2、结果与分析
2.1不同碳源对产菊粉酶的影响
试验结果表明，以2%菊芋汁为碳源时酶活力最高，为12.33U/mL;菊粉次之，为10.18U/mL;葡萄糖、果糖为碳源时酶活力较低，均在 2.5U/mL以下。进一步分析不同浓度菊芋汁为碳源对产菊粉酶的影响，发现菊芋汁浓度为3%时，菊粉酶活力最高，为11.18U/mL。
2.2不同氮源对产菊粉酶的影响
研究结果表明，复杂有机氮源比简单无机氮源有利于菊粉酶的产生，且最适有机氮源为牛肉膏，无机氮源为(NH4)2HPO4，2种氮源所得到的菊粉酶活力分别为14.14、8.64U/mL。由表1可以看出，复合氮源比单纯有机或无机氮源更有利于菊粉酶的产生，且当牛肉膏和(NH4)2HPO4的质量浓度分别为2%和0.5%时，菊粉酶活力最高，为19.98U/mL。
2.3培养基初始pH值对产菊粉酶的影响
检测不同初始pH值对黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶的影响，结果如图1所示。可以看出，在初始pH值为3~6的范围内，随着pH值升高，菊粉酶酶活增强，pH值为6.0时产菊粉酶酶活最高，达到28.83U/mL。此后随着pH值升高，菊粉酶酶活明显下降。
2.4发酵温度对产菊粉酶的影响
试验结果表明，在24~30℃范围内，随着培养温度升高菊粉酶酶活增强，30℃时产菊粉酶酶活最高，为32.51U/mL。此后，随着温度升高，菊粉酶酶活明显下降，说明菊粉酶对温度比较敏感。因此，30℃是黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶的最适温度(图2)。
2.5发酵时间对产菊粉酶的影响
可以看出，随发酵时间的增加，黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶活力增强，在培养72h后产菊粉酶酶活最高，为35.21U/mL。此后，随着发酵时间延长，菊粉酶酶活有下降趋势。