叶绿体中色素的提取和分离实验中容易出现的问题论文
在高中生物实验中，“叶绿体中色素的提取和分离”是一个重要的实验,学生在做这个实验时容易出现以下几个问题：
一是研磨植物叶片的时间过长，掌握不好加入二氧化硅的用量，往往是二氧化硅过量，致使滤液含有较多的二氧化硅，滤液颜色变浅，影响实验效果；
二是毛细吸管易堵塞，色素线画得不够细、平、齐，使色素带重叠；
三是层析液中含有苯，苯是一种毒性很强的有机物；
四是在分离色素时，滤纸条上的滤液细线容易没及到层析液，使色素溶于层析液中，导致色素不清晰。做这个实验，主要是让学生通过实验操作，学会提取分离叶绿体中色素的方法和技能，在探索、思考和主动实践中，吸取知识、应用知识、分析问题、解决问题，从而培养学生的科学素养、创新精神和实践能力。
一、实验前的知识准备
1、证明叶绿体中存在色素。取一支干燥的白色粉笔，将其一端（约0.7cm）竖直浸入预做好的叶绿体色素提取液中，充分吸液后，使其稍微干燥，接着将该端竖于95%的'乙醇中，片刻后，粉笔会出现四条不同颜色的色带。
2、实验原理：由于光合作用色素位于叶绿体中的类囊体膜上，要把它提取出来就必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎叶片后加入二氧化硅进行研磨，以便使色素被充分提取，又因为叶绿体中色素不溶于水，但可溶于有机溶剂，如酒精或丙酮，形成色素液，所以要加入丙酮使色素溶解来提取各种色素。另外要加碳酸钙以保护叶绿体中的色素，原因是碳酸钙可调节色素液中的酸碱度，防止叶绿素被破坏。分离叶绿体色素常用的纸层析法是一种分配层析，即利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶液中的分配系数差异将它们分离。在纸层析中的流动相是指层析液，在毛细拉力作用下，层析液可不断地由下向上流动。由于滤纸纤维素上的羟基亲水性，因此水分子被吸附在纤维之间不易扩散而成为固定相。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经色素滤液细线时，滤液细线的色素就相继融入层析液，随层析液上升并发生再分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中直到平衡。由于分配系数不同，那些分配系数大的色素分子随层析液向上移动得快，形成的色素带集中在液纸的上部；而分配系数小的色素分子随层析液向上移动得慢，形成的色素带集中在滤纸的下部。
叶绿素a和叶绿素b的结构相似，但前者有一个烷基，而后者只有一个醛基，前者分子量较后者小，故叶绿素a比叶绿素b在滤纸上扩散的速度较快；β胡萝卜素与叶黄素结构相似，但叶黄素比β胡萝卜素多两个醛基，且分子量比β胡萝卜素大，故叶黄素在滤纸上移动速度较β胡萝卜素慢。所以色素带从上到下依次为β胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b。
二、实验材料的选择和处理
为莸取高浓度滤液，要选择新鲜的颜色较深的成熟叶片，叶片表面没有或者少有蜡质层，细胞含水量少且较软，同时这种叶数量多容易购买得到，如菠菜叶、胡萝卜叶。选择的叶片要去柄晾干水分。
三、解决问题的方法
1、制备层析液时，用20份石油醚、2份丙酮和1份甲苯混合而成，用甲苯代替课本介绍用的苯。经多次实验证明，在滤纸条上出现四条色带的几率大大提高，并且甲苯的毒性比苯小，减少了对学生和老师身体的危害。
2、制备滤纸条时，据小孔（边缘）扩散原理，物质分子沿边缘扩散速度大于里边扩散速度，因此要将滤纸一端剪去两角，主要为了增长边缘长度，这样可使色素在滤纸条上扩散均匀，便于观察实验结果。并且，在实验前要将制备好的滤纸条放进干燥箱中充分干燥。
3、为充分研磨叶片，加入二氧化硅破坏细胞结构。由于二氧化硅是特别细的白色粉末，加上不好控制用量往往过量，使滤液含有较多的二氧化硅导致滤液颜色变浅，使实验现象不明显，改用干燥的白细河沙代替二氧化硅粉末，这样研磨更充分，滤液中减少了杂质含量，颜色变深绿，实验效果明显。
4、加入少许碳酸钙与叶片一起混合研磨，用以中和有机酸，防止叶绿素受到破坏而保持色素结构。
5、研磨要迅速、充分。原因有三个：一是丙酮有毒且易挥发；二是为使叶绿体完全破裂，能提取较多色素；三是叶绿素极不稳定，容易水解。
6、在玻璃漏斗底部放一块双层的尼龙布，将研磨液迅速倒入其中过滤，将滤液收集到试管中后及时用胶塞塞紧，防止氧气氧化分解色素。
7、为了得到清晰的四条色素带，改进课本中在滤纸条上画滤液细线的方法，使滤液细线接近“细、直、齐”的要求，即用盖玻片代替毛细吸管。操作方法：用拇指和食指夹住常规盖玻片，然后用其一边沾取少量色素提取滤液，对准滤纸条上原来用铅笔画出来的细线，垂直放下，接触滤纸条后稍用力，便得到较理想的滤液细线，最后分离的色素带也较明显，能清晰地观察到不同色素的分布、颜色和宽度。
8、在分离色素时，将3ml层析液倒入100ml烧杯中，将滤纸条上画有滤液细线的一端朝下，略微斜靠着烧杯的内壁，轻轻插入到层析液中，另一端轻折一下钩住烧杯口边缘，但不要让滤纸条上的滤液细线接触到层析液，这样可防止色素溶于层析液中，导致色素带不清晰，影响实验效果。
在实验教学中，让学生了解实验原理，在保证实验安全的前提下，要求学生严格操作、细心观察，一丝不苟地对待实验操作的每一步骤，这是实验成功的必需条件。实验取得成功会激发学生对实验教学产生浓厚兴趣和热情，同时也能培养学生科学严谨的学习态度，对培养和提高学生整体素质具有重要的促进作用。
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