当归炭饮片质量标准研究
本文选取甘肃道地产区的当归，按照《甘肃省中药炮制规范》规定的方法炮制，采用传统鉴别和色谱指纹图谱结合的方法来控制当归炭饮片的质量，为当归炭饮片质量控制提供科学依据。
【摘要】
目的建立当归炭饮片质量控制方法，为其质量标准的制定提供依据。方法观察当归炭饮片性状;对其粉末进行显微鉴别;根据《中国药典》规定的方法测定水分、灰分、酸不溶性灰分及其浸出物;采用薄层色谱法对其进行鉴别;基于当归炭饮片HPLC图谱，以阿魏酸峰为基准峰，计算阿魏酸的含量，对样品中指认的指纹峰以阿魏酸为参照，计算每个指纹峰以阿魏酸计的含量。结果当归炭和生当归相比，外观性状、显微结构发生了较明显的变化，组织颜色加深，淀粉粒被糊化，油细胞被破坏。水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物测量平均值分别为3.3%，11.5%，4.1%和49.2%，确定了1个指纹峰，计算出指纹峰以阿魏酸计的含量。结论建立了当归炭饮片多指标成分的定量方法，方法具有可操作性，使药品质量控制更全面。
【关键词】
当归炭饮片; 质量控制; 定量方法; 阿魏酸
Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of carred Radix. Angelica Sinensis. MethodsTraditional identification， TLC and fingerprints of Carred Radix Angelica Sinensis were adopted to control quality of carred Radix Angelica Sinensis. The ten common peak were appointed as fingerprint peaks， all the fingerprint peaks were quantified grounded on the peak of Ferulic acid. Referring to China Pharmacopoeia (25)， water， ash， and extract were also detected.
ResultsAppearance， microscopic structure of Radix Angelica Sinensis changed obviously， color of tissue deepened， starch granule gelatinized， oil cells were destroyed. The content of water， total ash， acid-insoluble ash and extract were 3.3%，11.5%，4.1%and 49.2%， respectively. Ten fingerprint peaks were defined， and quantified rested on the peak of ferulic acid. ConclusionA multicomponent quantitative method for the carred Radix Angelica Sinensis was established. The established method is feasible. The quality control standards of the carred Radix Angelica sinensis is normative， systematic and accurate.
Key words： Carred Radix Angelica Sinensis; Quality standards; Quantitative method; Ferulic acid
当归为伞形科当归属植物当归Angelica sinesis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，主产于甘肃岷县，属甘肃地道药材，主要成分含挥发油和水溶性物质两大类。挥发油中以藁本内酯和正丁烯酉夫内酯为主要成分;水溶性物质以阿魏酸和丁二酸为主要成分[2]，是中(兽)医临床常用药，性温，味甘、辛，具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效。当归炭入药，最初见于明代方贤《奇效良方》成为“火化法”，之后清代又有“煅法”“烧法”的记录，如“烧末为灰”，但均需存性，当归炭至今仍为中医临床所选用[3]，由于当归本有活血作用，炒炭后又善止血，所以当归炭尤宜于瘀阻出血证。当归炭质量优劣直接关系到中医及中兽医临床的.疗效，而目前还没有一个系统的质量控制的方法。因此，本文选取甘肃道地产区的当归，按照《甘肃省中药炮制规范》规定的方法炮制，采用传统鉴别和色谱指纹图谱结合的方法来控制当归炭饮片的质量，为当归炭饮片质量控制提供科学依据。
1 材料与仪器
1.1 实验仪器显微镜，自动薄层制板器，KQ-36DE型数控超声波清洗器，玻璃仪器烘干器，TDI5-WS多管架自动平衡机，电子天平，克罗玛-薄层观察分析仪(254nm，365nm)，容量瓶，坩埚，电热恒温鼓风干燥箱，SX-4-1智能纤维素电阻炉，循环水式多用真空泵(型号SHB-111)。
1.2 实验药品乙醚、乙醇、石油醚、醋酸乙酯、1%碳酸氢钠、甲醇、硅胶G薄层、阿魏酸、正己烷、苯、2%碳酸钠、水合氯醛、稀甘油等所用试剂均为分析纯。当归对照药材(批号12927-2613中国药品生物制品检定所)，阿魏酸对照品(批号773-991中国药品生物制品检定所)。
1.3 当归炭取当归片，置锅内，用中火炒至当归外表焦黑色，内部棕褐色，略具焦气，质枯脆时， 取出放凉。并要注意“炒炭存性”[4]。不同产地当归炭样品分别为t1甘肃漳县金钟镇;t2甘肃岷县中寨镇;t3甘肃九寨镇;t4甘肃岷县;t5甘肃渭源县;t6甘肃渭源县;t7甘肃渭源县;t8甘肃岷县;t9甘肃昌县;t1号甘肃漳县;t11甘肃昌县哈达铺;t12甘肃漳县;t13甘肃岷县;t14甘肃省岷县市场购买。
2 方法
2.1 饮片性状当归炭：当归头切片有大有小，最大的长为2.6 cm，宽为1.7 cm，厚为.2 cm;最小的长为1.2 cm，宽为1. cm，厚为.1 cm，表面颜色为黑色具纵皱纹，断面形成层为深褐色具环纹，木质部为棕褐色，还混有粗细、长短不一的归身、归尾其表面均为黑色，根头部断面层有裂缝。掰开断面颜色为黄棕色，质脆，香气较浓味苦、微甜。见图2。
2.2 饮片鉴别
2.2.1 粉末显微鉴别当归炭：粉末为焦黑色，可观察到梯纹、网纹、螺纹导管呈棕褐色，木栓细胞也呈棕褐色，纺锤形薄壁细胞有但较少，碎片较多油室基本少见，淀粉粒糊化。见图3。
2.2.2 薄层色谱鉴别取14个产地当归炭粉末.5 g，加乙醚1 ml，超声处理1 min，滤过，取滤液蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取标准当归粉末.5 g，依供试品同法操作，即为对照品溶液;吸取上述15种溶液各5 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚(3～6℃)醋酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯下365 nm波长处观察荧光斑点。见图4。
取14个产地当归炭饮片粉末3 g，加1%碳酸氢钠5 ml，超声处理1 min，离心，取上清液，用稀盐酸调至pH值2～3，用乙醚振荡萃取两次，2 ml/次。合并乙醚液蒸干，残渣加甲醇1ml，使溶解，作为供试品溶液。吸取上述14种溶液各1 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上;另吸取1 μl阿魏酸点于同一块硅胶G薄层板上作为对照样品。以正苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶1∶.1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯下365 nm波长处观察荧光斑点。见图5。
2.3 检查照《中国药典》25 年版Ⅰ部(附录)，分别测定当归样品中的水分，总灰分，酸不溶性灰分，浸出物测定法项下醇溶性浸出物测定法热浸法测定。结果见表1。表1 14个产地当归样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物测定结果(略)
2.4 基于当归炭饮片的HPLC图谱的样品含量测定
2.4.1 色谱条件Agilent Zorbax SB2C18 (4.6 mm×25cm，5μm)分析柱;流动相:1%乙酸水(A相)：乙腈(B相);梯度洗脱条件:B，～1 min (8% ～13%);18～2min(13%～18%);2～28min(18%～2%);28～5 min (2%～49% );5～55 min (49% );55～75 min(49% ～1%)。流速:1 ml·min-1;柱温:25 ℃;检测波长:28 nm。
2.4.2 阿魏酸对照品溶液制备称取阿魏酸对照品4.8 mg，加甲醇至1 ml容量瓶中，得4.8 μg·ml-1对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液制备精密称取当归粉末(4目).5 g，置5 ml具塞三角瓶中，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液25 ml加入三角瓶中，密封，称重，超声提取6 min，放置至室温，称重，补足失重， .45 μm滤膜过滤。取续滤液进样1 μl。
2.4.4 指纹峰的鉴定采用相对保留时间确认峰。指纹峰峰面积比值即各指纹峰面积与同一图谱中阿魏酸峰面积的比值。
3 结果
3.1 方法学考察精密度 取同一份当归样品(t4)的供试液，重复进样5次，计算得各主要色谱峰的相对保留时间RSD为.3%～.14% ， 峰面积比值RSD为.54%～2.6% ，符合指纹图谱的检测要求。
3.1.1 稳定性取同一份当归样品(t4)的供试液，分别于，3，6，9，12和15 h检测，计算各主要色谱峰的相对保留时间RSD为.3%～.12%，峰面积比值RSD为.29%～2.66% ，表明供试液在15 h内基本稳定。
3.1.2 重复性取当归样品(t4) 6份，分别精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备供试液，再分别按上述液相色谱条件测定， 计算各主要色谱峰的相对保留时间RSD为.28% ～.46%，峰面积比值RSD为.75% ～1.82% ，符合指纹图谱的检测要求。
3.1.3 当归样品中指纹峰的定量按上述液相色谱条件测定了自14个不同产地的当归炭样品，根据各样品图谱中色谱峰的相对保留时间和阿魏酸对照品的相对保留时间，鉴定1个指纹峰，见图6。峰1为阿魏酸，将指纹峰的紫外光谱与文献[5～8]比较，推测峰2～1依次为洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、丁基酜内酯、E-藁本内酯、Z-藁本内酯、Z-丁烯基酞内酯、levistolide A.。对这些指纹峰含量以基准峰阿魏酸为依据，计算每个指纹峰的相对含量。结果见表2。表2 14批当归炭样品指纹峰以阿魏酸计相对含量测定结果(略)
4 讨论
“道地药材”是公认的优质药材，可以用某中药的道地药材的质量情况作为该中药的质量标准。本研究选择甘肃道地产区的当归样品，对当归炭(14批)各组研究数据资料进行系统分析，以此为基础制定当归炭饮片的名称、药材来源、饮片规格、显微鉴别、水分限量、总灰分限量、酸不溶性灰分限量、浸出物限量及以阿魏酸为基准的有效成分相对含量下限等质量标准。研究发现当归炭的显微结构发生了较大的变化，组织颜色加深、油细胞减少、淀粉粒基本都被糊化等，而其外部变化也非常明显，如表面呈焦黑色等，水分含量明显下降，而灰分含量明显增加，建议在制定当归炭饮片质量标准时考虑。
当归炭饮片作为多组分复杂体系，其化学成分经过炒炭以后发生了很多变化，如宋金春[9]报道，制炭后，阿魏酸含量显著降低，鞣质显著增加，水溶性和醇溶性成分均有下降，加上药材品种、产地、加工、贮藏等因素的影响，其质量控制一直是当归炭饮片分析的重点和难点。目前对当归炮制品的研究大多停留在饮片的性状鉴别，25版《中国药典》上只是规定了酒当归饮片的性状，没有化学成分的鉴别方法，无法从化学组分的内在因素上鉴定当归炮制品以控制其质量，且对当归药材只规定了阿魏酸含量的限度，也不能代表整个药材的质量[1]，同时市场上能形成商品的对照品数量较少，一味药多成分定量就成为质量分析的难点。本研究针对以上问题，在分析出的组分中尽可能多地选取含量测定对象，选择一个能代表某味药材的组分色谱峰， 然后再选择其他各味药材代表峰，并对代表峰与标准峰比值作一限度范围，即可对所要检测中药做出一个较好的定性定量，以此来控制制剂的质量[11]。本文采用以阿魏酸单一对照品为基准对多指标成分定量分析方法，测定洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、丁基酜内酯， E-藁本内酯、Z-藁本内酯、Z-丁烯基酞内酯、levistolide A 1种成分以阿魏酸计的相对含量，这样可以全面控制当归炭饮片的质量，提高当归炭饮片质量控制水平，为其质量评价提供科学依据，同时为当归炭饮片的生产、经营及鉴定提供了参考标准。
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