氧环境影响关节软骨细胞表型的相关研究分析
由于软骨自身修复能力差，一旦损伤即产生永久性病变。那么，氧环境影响关节软骨细胞表型的相关研究是?
【摘要】 [目的]观察检测低氧和常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因及蛋白表达的改变。[方法]采用3～5日龄c57bl/6小鼠，取四肢关节软骨，经机械分离和酶消化法获得关节软骨细胞，将原代细胞p0和传代后细胞p1、p2分别在普通和低氧培养箱中培养2 d，用rt-pcr检测ii型胶原、可聚蛋白聚糖和sox9特异性基因及ihh、pthrp、bmp4、wnt5a分化相关基因的表达差异，原代软骨细胞用免疫组化和阿利新蓝染色检测ii型胶原、可聚蛋白聚糖的蛋白表达。[结果]低氧条件下，免疫组化显示ii型胶原和可聚蛋白聚糖的表达较普通培养增强，ii型胶原、wnt5a的基因表达增强，ihh的表达降低;传代后软骨细胞的蛋白、特异性基因和分化相关基因表达未见明显差异。[结论]低氧条件下，原代软骨细胞的ii型胶原表达增强，且可能主要是受ihh、wnt5a等分化相关基因的调控。短期单层培养方式不能明显改善、 恢复特异性基因表达降低的传代后软骨细胞表型。
【关键词】 软骨细胞 低氧 ⅱ型胶原 蛋白聚糖
effect of oxygen tension on chondrocytic phenotype in vitro
liang jing, deng lian-fu, zhu ya-ping，et al.
shanghai institute of traumatology and orthopaedics, orthopaedic department of ruijin hospital, shanghai 200025, china
abstract: [objective]to examine the specific gene and protein expression of primary and passaged chondrocytes in normal oxygen tension and hypoxia. [methods]articular chondrocytes were isolated from limb joint cartilage of c57bl/6 mice (3～5 days). primary chondrocytes (p0) and passaled chondrocytes (p1, p2) were cultured in normal oxygen tension and hypoxia respectively for two days.the mrna levels of collagen ii, aggrecan, sox9, indian hedgehog (ihh), parathyroid hormone-related protein (pthrp), bone morphogenetic protein (bmp)-4 and wnt5a were examined with rt-pcr, and protein levels of collagen ii,aggrecan were examined with immunohistochemistry and toluidine blue staining.[results]during the culture of primary chondrocyte, the expression of collagen ii and aggrecan increased under hypoxia, mrna levels of collagen ii, wnt5a increased and ihh decreased at the same time.the mrna levels of special genes and differentiation related genes of passaged chondrocytes were not altered under hypoxia.[conclusion]protein and mrna level of collagen ii of primary chondrocyte under hypoxia increased. it may be regulated by chondrocyte differentiation gene ihh,and wnt5a. the chondrocyte phenotype could not be resumed under hypoxia through short-term monolayer culture in vitro.
key words：chondrocyte; hypoxia; collagen type ii; aggrecan
正常生理情况下，关节软骨无直接的血液供应，主要通过关节滑液和软骨下骨组织来间接提供，与其它由动脉血供应的组织相比，关节滑液的氧分压仅约7%，关节软骨表层的氧分压为7%，深层则低于1%，故体内软骨细胞是始终处于低氧环境中的。wWW.133229.COm关节损伤、退变等病理情况时，损伤、炎症等引起关节滑液中氧分压明显降低，导致软骨内氧分压相应下降，影响细胞外基质新陈代谢，将会直接或间接影响关节软骨细胞的正常代谢和功能发挥[1]。软骨细胞在体外单层培养时随传代次数增多细胞易发生去分化，细胞呈成纤维细胞样变，ii型胶原及可聚蛋白聚糖表达减少，i型胶原表达增加[2]。为进一步了解低氧对体外培养的软骨细胞表型变化的影响，本实验拟观测低氧与常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因、分化相关基因及蛋白量的改变。
1 材料和方法
1.1 关节软骨细胞的分离和培养
3～5 d龄c57bl/6小鼠20只，断颈法处死，75%酒精浸泡3 min。在超净台上用眼科剪离断四肢，解剖显微镜下清理髋、膝、肩、肘关节周围皮肤、肌肉和软组织，分离出软骨块，放入盛有dmem(gibco，usa)培养基的培养皿中。d-hanks液冲洗2次，将软骨块剪碎，置入锥形瓶中用5倍体积的`0.25%胰蛋白酶(sigma)，37℃预消化半小时，过滤后将软骨块重新置入锥形瓶用0.2%的胶原酶(sigma)继续消化，待大部分软骨块消失，终止消化。过滤获得细胞悬液，1 200 r/min离心8 min，去上清，无血清培养基洗涤2次，所得细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清(jrh，usa)的dmem中，按2.5×105/ml接种于25 cm2培养瓶中，以8×105/ml接种于预置有盖玻片的24孔板中，设3个复孔，置于37℃、5%co2饱和湿度的培养箱中培养，即p0，每2 d换1次液。
1.2 rt-pcr检测软骨细胞特异基因和分化相关基因的表达
1.2.1 细胞标本收集
待5 d细胞长满后以相同密度接种传代即p1、p2，并分别将70%～80%融合的p0、p1、p2置于普通培养箱和2%o2(n2平衡)培养箱(model 3110，thermo)中培养2 d。用trizol裂解沉淀细胞后，抽提rna。
1.2.2 rt-pcr反应
取rna 2 μg，随机引物1μl， 加水至12 μl ，70℃5 min置于冰上;5×反应缓冲液4 μl，10 mmdntp 2 μl，rnase抑制剂0.5 μl，加水至19 μl ，25℃ 5 min;逆转录酶(m-mlv)1 μl，42℃ 1 h，70℃10 min，置于冰上终止反应。按照94℃5 min～-94℃30秒，以各基因退火温度30秒，72℃20秒～-72℃ 7 min进行pcr反应，各基因引物见表1。取10 μl pcr反应产物行琼脂糖凝胶电泳。用天能凝胶图像处理仪紫外灯下观察并拍照。
1.3 软骨细胞表型鉴定
将不同氧环境下24孔板中的玻片取出，进行ii型胶原和蛋白聚糖(aggrecan)的免疫组化染色及阿利新蓝染色。
1.3.1 ii型胶原和aggrecan的免疫化学染色
培养细胞依次执行下列步骤：吸去培养液，pbs洗2次，10 min/次;4%多聚甲醛室温固定15 min;3%h2o2离子水孵育10 min，消除内源性过氧化酶活性;牛血清白蛋白封闭20 min;一抗ii型胶原(1∶100)、aggrecan(1∶50)孵育过夜;二抗37℃孵育1 h;加abc30～60 min;滴加dab液，镜下观察显色;pbs缓冲液冲洗，脱水，透明，封片。
1.3.2 阿利新蓝染色
吸去培养液，pbs洗2次，10 min/次;4%多聚甲醛室温固定15 min;pbs洗3次，3 min/次;1%阿利新蓝染色30 min;蒸馏水冲洗;脱水，透明，封片。
2 结果
2.1 软骨细胞形态学观察
接种后24 h，倒置显微镜下观察，大部分小圆形细胞已经贴壁。继续培养，典型的软骨细胞为上皮样细胞，外形为多边形或圆形，胞浆丰富，胞核圆形，居中。镜下细胞有立体感。5 d左右细胞融合，呈明显的铺路石样外观。传代后，细胞由圆形、多边形变成长梭形，并有大量的突起出现。
2.2 软骨细胞标志性基因和分化相关基因表达(图1、表2)
rt-pcr半定量结果：各样本基因表达量=各样本目的基因净光密度/各样本β-actin净光密度(x-±s，n=3)。经机械分离和酶消化方法获得的细胞表达ii型胶原、sox9和aggrecan，并且低氧培养时标志性基因的表达高于普通培养。传代后，特异性基因的表达量降低，低氧培养和普通培养未见有明显差异。ihh的表达：原代软骨细胞及传代后p1低氧培养时低于普通培养，传代后p2两种条件下均无ihh的表达。pthrp的表达：原代和传代后软骨细胞低氧培养时pthrp的表达均低于普通培养，且传代对pthrp的表达没有什么影响。bmp4的表达：低氧条件下，随着传代，软骨细胞bmp4的表达逐渐降低，普通培养时bmp4的表达基本一致，且原代细胞低氧时bmp4表达高于常氧，传代后p2低于常氧。bmp7的表达：原代细胞两种条件下bmp7的表达没有明显差异，传代后p2低氧培养时bmp7表达明显高于普通培养。wnt5a的表达：传代后，wnt5a的表达降低，且两种条件下没有明显差异。原代软骨细胞低氧培养时wnt5a的表达高于普通培养。表1 rt-pcr反应各基因引物序列及反应条件目的基因引物序列产物大小
(略)
2.3 细胞免疫化学染色和阿利新蓝染色(图2)
低氧和普通培养时原代软骨细胞均有大量免疫化学染色阳性的棕褐色细胞和阿利新蓝染色阳性细胞，低氧时软骨细胞着色多深于普通培养。传代后，细胞形态由圆形、多边形变为长梭形，且胞体变大，突起增多，ii型胶原和aggrecan染色着色变淡，两种条件培养没有明显差异。
2.4 统计分析
rt-pcr半定量结果用均数±标准差(x-±s)表示，采用spss 11.5软件进行分析，用非配对t检验，p<0.05有统计学意义。
3 讨论
关节软骨急性损伤、慢性劳损及年龄增长引起的退变等病理情况下，由于软骨自身修复能力差，一旦损伤即产生永久性病变。随着组织工程学的发展，关节软骨损伤的修复技术也取得了长足进展。种子细胞-软骨细胞的来源及体外的扩增培养是组织工程学修复软骨的重要环节。软骨组织较之其他血供丰富的组织器官，其组织内氧分压更低。在关节软骨组织不同区带，氧分压存在着差异，介于1%～7%之间。软骨细胞处于低氧环境，通过糖酵解获取能量。低氧是软骨细胞生长和存活的一个关键因素。低氧可促进软骨细胞分化和软骨基质合成，但抑制软骨细胞的最终分化，并且低氧能明显促进间充质细胞向软骨细胞方向分化，促进软骨基质合成，在细胞培养和器官培养中均抑制最终分化[3]。所以适宜的氧环境也是体外软骨细胞生存的重要条件。表2 常氧和低氧条件下关节软骨细胞p0、 p1、p2各基因mrna表达的rt-pcr半定量结果(略)
软骨细胞为维持软骨的特性会分泌特异的蛋白。ii型胶原是关节软骨内表达最多的胶原蛋白，它与其他胶原相互交织形成纤维网，使软骨组织具有张力和剪力特性，并固定基质中的蛋白多糖。可聚蛋白聚糖是软骨基质内另一个重要组成部分，它由一个核心蛋白与糖胺聚糖以共价结合。sox9是调控间充质细胞向软骨方向分化的必要因子，sox9表达后，进一步诱导下游相关基因ii型胶原等的表达。
murphyl等[4]用藻酸钙包被去分化的软骨细胞，4周后发现低氧条件下(5%)培养的软骨细胞的特异性基因ii型胶原表达与原代完全相同，可聚糖胺多糖及sox9的表达甚至高于原代细胞。本实验中，原代软骨细胞经低氧干预后，ii型胶原的基因表达明显高于普通培养，免疫组化染色和阿利新蓝染色也证实ii型胶原和蛋白聚糖的表达增高。传代后，软骨细胞的标志性基因表达降低，发生去分化，低氧干预和普通培养条件下没有明显差异。在软骨内骨形成过程中，ihh/pthrp和bmps家族参与了对软骨细胞分化的调控。ihh/pthrp形成负反馈环来调控软骨细胞向肥大软骨细胞分化的启动，而bmps家族也和这一负反馈环相互作用，参与调控。ihh可以促进软骨细胞增殖，并促使软骨细胞由增殖期向肥大期转化，分泌x型胶原。ihh信号活化后，可以上调pthrp的表达，pthrp可以使软骨细胞维持在增殖状态，抑制增殖性软骨细胞的肥大化分化，并下调ihh的表达。另外，ihh也可以不依赖于pthrp直接调控软骨细胞增殖[5]。有实验证实，外源性bmp4能以剂量依赖方式促进软骨生长、基质沉积和软骨细胞增殖，较大剂量能够诱导异位肥大软骨细胞的生成[6]。wnt5a在增殖型软骨细胞和前肥大软骨细胞表达，可以促进软骨细胞增殖，维持软骨细胞变为关节/静息软骨细胞的状态，抑制其分化[7]。普通培养条件下，软骨细胞传代后各分化相关基因表达基本不变;低氧培养时，ihh的表达较常氧降低，wnt5a的表达较常氧升高，说明低氧条件更利于软骨细胞保持增殖状态，传代后，ihh、 bmp4的表达较常氧均下降，wnt5a与常氧相似，则可能ihh和bmp4参与了低氧条件下传代后软骨细胞表型的调控。低氧条件下原代及传代后软骨细胞pthrp表达低于常氧培养，可能是由于ihh表达量较低不足以启动ihh/pthrp负反馈环。本实验证实越接近于体内环境更容易保持软骨细胞的生物学特性，但是传代后软骨细胞经低氧单层短期培养，并未见明显的软骨细胞特异的表型基因表达的增高，所以单纯的氧环境改变并不能恢复软骨细胞的表型。
组织工程修复关节是治疗关节损伤、退变的重要手段，而维持体外软骨细胞表型是需要解决的关键技术。低氧环境接近于体内的生理环境，本实验中低氧条件下原代软骨细胞的表型基因表达较常氧增高，促进软骨细胞分化的基因ihh表达降低，抑制软骨细胞分化的基因wnt5a表达增高。由此，低氧环境也许是组织工程中软骨细胞准备的必要条件，更易于发挥修复材料的治疗作用。
低氧是体内软骨细胞的生存环境，体外培养也观察到软骨细胞较之常氧培养时表型特异性基因的表达增强，但是低氧条件下引起软骨细胞特性改变的使动因素、相关基因和病理条件下(骨关节炎等)、年龄增大引起的关节软骨内氧浓度降低没能逆转软骨细胞的变性，其原因还不是很清楚，这有待于进一步研究。
【参考文献】
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